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本试剂盒是一种非常便捷和高效的通过酶学方法将单链RNA (ssRNA)转化成环状RNA (circRNA)的试剂盒。合成的circRNA可以用于转染细胞研究circRNA的生物学功能等。近期有研究表明环状RNA也可以用作mRNA疫苗(mRNA vaccine)，包括新冠病毒(SARS-CoV-2)等的疫苗。

本试剂盒环化效率高，操作便捷。环化效率通常可以达到95%以上，且操作仅需一步孵育即可完成。通常本试剂盒能将95%以上的5’磷酸化3’羟基的单链RNA (ssRNA)转化成环状RNA (circRNA)，因此环化产物可以不需要切胶纯化，仅需热失活环化酶后通过乙醇沉淀即可用于后续实验。

本试剂盒进行单链RNA的环化反应的原理是，通过RNA环化酶(RNA Cyclase)环化5’磷酸化3’羟基的单链RNA。


本试剂盒催化5'磷酸化3'羟基的单链RNA分子环化连接生成环状RNA的效果参见图1。

图1．使用百奥莱博的Circular RNA Synthesis Kit制备环状RNA (circular RNA,circRNA)的效果图。反应体系为20μL，单链RNA的终浓度为0.5μM，反应条件为37℃孵育30min，反应完毕后在65℃孵育15min终止反应，随后取样用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶在冰水浴中进行电泳，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本试剂盒在30min内就可以将95%以上的5'磷酸化3'羟基的单链RNA转化为环状RNA。

环状RNA是一种通过典型的5'-3'磷酸二酯键形成的环状结构的RNA分子，这种结构特征使得其不受RNA外切酶的影响，表达更稳定，不易降解。circRNA是生物体内源存在的一种通常为单链的环状RNA，可以在内含子反向剪接(trans-splicing)等过程中产生。

环状RNA的研究可以采用质粒或病毒表达的方式，通过反向剪接等产生circRNA。但通过质粒或病毒等产生circRNA的过程中涉及反向剪接等辅助性的过程，有可能会干扰研究结果。如果能直接转染合成的circRNA，就能更直接地研究circRNA的生物学功能。

组分	20T	100T
RNA Cyclase	20μL	100μL
10×RNA Cyclase Buffer	50μL	250μL
20×Cyclase Enhancer I	30μL	120μL
5×Cyclase Enhancer II	100μL	500μL
DEPC-treated Water	400μL	2mL
说明书	1份	1份

保存：-20℃保存，有效期1年。

• 底物单链RNA的3’端必须是羟基，5’端可以是磷酸化，也可以是腺苷酰化。
  
• 本试剂盒提供的环化反应体系可以按照比例放大反应体系，对环状RNA产物的得率无显著影响。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配制反应体系：
  参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  DEPC-treated Water	11.5μL	-
  ssRNA (20μM)	0.5μL	0.5μM
  10×RNA Cyclase Buffer	2μL	1×
  20×Cyclase Enhancer I	1μL	1×
  5×Cyclase Enhancer II	4μL	1×
  RNA Cyclase	1μL	-
  Total Volume	20μL	-

  
  注意：
  
  • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DECP处理去除RNase或者确保是RNase free的。由于涉及单链RNA，可以考虑适量添加RNase Inhibitor(货号：YT530)，尽管我们实测不添加RNase Inhibitor时也可以获得良好的连接效果。
    
  • 上述表格中ssRNA的用量已经比较大，对于样品比较少的情况下，完全可以大幅减少ssRNA的用量的。
    
  • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
  
  
• 环化反应：
  37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h或16℃孵育16h。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
  
• 终止反应：
  65℃孵育15min，即可终止反应。
  
• 环化产物的电泳鉴定：
  电泳上样前95℃孵育5min随后置于冰浴，以充分变性。尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行凝胶电泳分析。环状RNA的电泳迁移率会变快一点(参考图1)。
  
• 浓缩与纯化：
  可以采用常规的乙醇沉淀方法进行浓缩并去除环化反应体系中的缓冲液成分。

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